Фізіолого-біохімічні механізми адаптації коропових риб на прикладі Danio rerio до впливу органофосфатних та триазинових пестицидів

Abstract

Органофосфатні та триазинові пестициди (включаючи інсектициди хлорпірифос, та гербіциди раундап та тербутилзин) є широко використовуваними агрохімікатами, глобальні ринки яких швидко зростають (Yang et al., 2020а). Відтак, хлорпірифос, гліфосат та тербутилазин, а також їх метаболіти, все частіше виявляються у зразках поверхневих вод, як поокремо так і в суміші, що ускладнює передбачення ефектів їх впливу на живі організми, адже більшість стандартизованих критеріїв якості води та протоколів оцінки ризику зосереджуються на токсичності окремих хімічних речовин (Albuquerque et al., 2016; Alvarez et al., 2019; Barata et al., 2006). Вважається, що риби є ефективними біоіндикаторами довготривалих токсичних впливів та різноманітних умов середовища існування завдяки своїй рухливості, здатності до акумуляції токсикантів та відносно тривалому періоду життя. Маючи здатність до акумуляції у живих організмах, пестициди, перебуваючи навіть у незначних концентраціях у товщі води або донних відкладеннях, можуть накопичуватися в тканинах риб (Olsvik et al., 2019), викликаючи при цьому істотні порушення молекулярних та біохімічних процесів з подальшою їх проекцією на організменний та популяційний рівень, що, у віддаленій перспективі, може викликати зменшення чисельності і порушення структури популяцій, а відтак, зменшення біорізноманніття в цілому. Риба даніо Danio rerio (Hamilton, 1822) широко використовується як модель у біомедичних та екотоксикологічних дослідженнях (Hollert and Keiter, 2015), у зв’язку з чим її генетика, фізіологія та розвиток добре вивчені. Багато критичних шляхів, які регулюють метаболізм, розмноження та розвиток, є висококонсервативними серед хребетних. Тому, оскільки ~ 70% генів людини мають принаймні один ортолог у геномі рибки даніо (Howe et al., 2013), вона є перспективною гіпотетичною моделлю для вивчення ризиків, спричинених пестицидами, для здоров’я людини та навколишнього середовища (Hollert and Keiter, 2015). Саме це спонукало нас використати D. rerio як модельний вид для оцінки біологічних ефектів і молекулярних механізмів токсичності широко використовуваних та детектованих у середовищі пестицидів (раундапу, хлорпірифосу, малатіону та тербутилазину) та їх сумішей. Незважаючи на те, що використані нами концентрації органофосфатних (раундап: 15 мкг/л та 500 мкг/л; хлорпірифос: 0,1 мкг/л та 3,0 мкг/л; малатіон: 5,0 мкг/л та 50,0 мкг/л) та триазинового (тербутилазин: 2,0 мкг/л та 30,0 мкг/л) гербіцидів та інсектицидів були значно нижчі, ніж зазвичай використовують в екотоксикологічних експериментах, вони відповідали їх фоновому вмісту у водоймах. Як результат, ми виявили палітру деструктивних змін на молекулярному та клітинному рівнях у коропової риби даніо, дотичних до окисного стресу, ендокринних порушень, імуно- та цитотоксичності, які за умов хронічного впливу можуть мати незворотні наслідки на стан функціональних систем організму та призводити до загибелі особин. Показано роль окисного стресу як важливого токсичного механізму та клітинної відповіді за впливу раундапу (гліфосат), хлорпірифосу та їх сумішей в екологічно реальних концентраціях. Досліджувані пестициди та їх суміші викликали у даніо пригнічення антиоксидантів, надлишкове вироблення активних форм оксигену, накопичення продуктів перекисного окиснення ліпідів і підвищений рівень фрагментації ДНК. Хлорпірифос був значно токсичнішим, ніж раундап, і додатково викликав нітрозативний і карбонільний стрес. У групах тербутилазину і малатіону ознаки окисного стресу поєднувалися із порівняно більш інтесивними процесами апоптозу та аутофагії, що, водночас, забезпечувало в експонованих тварин більш ефективне виведення продуктів окисного ушкодження, зокрема фрагментованих молекул ДНК. Прояви окисного стресу, особливо активні за впливу хлорпиріфосу та тебутилазину, зумовлювали на рівні організму розвиток ознак гепато- та нейротоксичності. За сумою ознак, раундап продемонстрував стимуляцію клітинних захисних механізмів за впливу низьких концентрацій, які, однак, були нівельовані за комбінованого впливу пестицидів, зокрема у присутності хлорпірифосу. Це означає, що індукований раундапом гормезис малоймовірний під час типового впливу агрохімічних сумішей на навколишнє середовище. Досліджувані нами пестициди проявляли помірні ознаки ендокриндизруптивної дії. Найбільш істотні докази ендокринних порушень спостерігалися за сумісного впливу тербутилазину і малатіону, однак обмежувалися інтенсивністю вітелогенезу та функціонуванням гіпоталамогіпофізарно-наднирковою осі, з незначним впливом або його відсутністю на гіпоталамо-гіпофізарно-надниркову та гіпоталамо-гіпофізарно-щитоподібну осі. Зважаючи на приналежність тербутилазину до класу хлоротриазинів, до яких належить атразин (відомий ендокрин-дизраптор) відсутність істотних розладів гормонального дзеркала вказує на його потенційні переваги використання, як замісника атразину. Пошкодження мітохондрій і лізосом можна віднести до неспецифічних ознак впливу досліджуваних органофосфатних песцтицидів та тербутилазину, які, у свою чергу, формують умови для розвитку метаболічних розладів та енергодефіциту. Зважаючи на те, що мобілізація захисних механізмів в умовах стресу є енергоємним процесом, енергодефіцит може бути лімітуючим фактором виживання особин в умовах зростаючого антропогенного пресу. Зазначимо, що комбіновані ефекти досліджуваних пестицидів для смугастого даніо мали характер антагонізму. Логічно припустити, що в таких випадках ефекти поокремих пестицидів, які входять до складу сумішей, можна спрогнозувати на основі окремих ефектів більш токсичного пестициду. Для хлорпірифосу це відповідає дійсності, однак у випадку тербутилазину та його поєднання з малатіоном призводить до виникнення ознак, які не були характерні для індивідуальної їх дії. Кілька нещодавніх робіт щодо адитивних або синергічних ефектів сумішей пестицидів, включаючи суміші фосфорорганічних кислот / карбаматів і фосфорорганічних кислот / купрум сульфатів (Heys et al., 2016; Laetz et al., 2009; Weeks Santos et al, 2021) показали, що антагоністичні взаємодії не можна поширювати на всі пестициди та, з іншого боку, варто передбачати очікувані ефекти сумішей за більш токсичним компонентом. Тому, навіть, якщо моніторинг більш токсичних пестицидів (таких як хлорпірифос) може бути виправданим, коли ресурси обмежені, то майбутні оцінки токсичності пестицидних сумішей на основі біологічного аналізу є необхідними для визначення рівня ризиків для навколишнього середовища і здоров’я, та повинні зосереджуватися на найбільш релевантних біомаркерах, такі як окислювальний стрес, гепато- та нейротоксичність. Таким чином, на підставі застосування методів машинного навчання нами визначено мінімальний набір показників для оцінки ризиків пестицидного забруднення для нецільових організмів, який включає на першому етапі показники імунної системи (IgM), ендокринних розладів (вітелогенін Vtg), репарації ДНК (RAD51) та цитотоксичності (LDH), з подальшою деталізацією оцінки функціонального стану організму на підставі визначення показників окисного стресу (ТБК-АП, Nrf2, загальної антиоксидантної здатності, GSSG), стрес-гормону кортизолу та ключового ензиму апоптозу Cas3.

Organophosphate and triazine pesticides (including insecticides such as chlorpyrifos and herbicides such as roundup and terbuthylazine) are widely used agrochemicals, the share of which on global markets is rapidly growing (Yang et al., 2020). Consequently, chlorpyrifos, glyphosate, terbuthylazine and their metabolites are being increasingly detected in surface water samples, both separately and in mixtures, making it difficult to predict the exposure effect for living organisms, hence most standardised water quality criteria and risk assessment protocols focus on toxicity of each chemical individually (Albuquerque et al., 2016; Alvarez et al., 2019; Barata et al., 2006). Fish are believed to be fine bioindicators of long-term toxic effects and diverse habitat conditions due to their mobility, ability to accumulate toxicants, and relatively long life span. Pesticides, given their ability to stockpile in living organisms, can accumulate in fish tissues even when being in low concentrations in the water column or sediments (Olsvik et al., 2019), which causes significant disruption of molecular and biochemical processes in fish. Subsequently, this projects on the organism and population levels, which in the long term can cause a decrease in population size and, consequently, shrink biodiversity in general. Danio rerio fish (Hamilton, 1822) is widely used as a model organism in biomedical and ecotoxicological research (Hollert and Keiter, 2015), hence its genetics, physiology and development are well understood. As many critical metabolic, reproductive and developmental pathways are highly conserved among vertebrates (e.g., ~70% of human genes have at least one ortholog in D. rerio genome (Howe et al., 2013)), this fush can be used to study pesticide risks to human health and environment (Hollert and Keiter, 2015). Therefore, we use D. rerio as a model organism to assess the biological effects and molecular mechanisms of toxicity of commonly used and detected pesticides (roundup, chlorpyrifos, malathion and terbuthylazine) and their mixtures. Despite the fact that the chosen concentrations (Roundup: 15 µg/L and 500 µg/L; chlorpyrifos: 0.1 µg/L and 3.0 µg/L; malathion: 5 µg/L and 50 µg/L) and triazine (terbutylazine: 2 μg/L and 30 μg/L) of organophosphate herbicides and insecticides were significantly lower than those commonly used in ecotoxicological experiments and corresponded to their background levels in water bodies, we found a palette of destructive changes at the molecular and cellular levels in the carp fish Danio, related to oxidative stress, endocrine disorders, immuno- and cytotoxicity, which, under conditions of chronic exposure, can obviously have irreversible effects on the body systems and lead even to death. We established the role of oxidative stress as an important toxic mechanism and cellular response under the influence of Roundup (glyphosate), chlorpyrifos and their mixtures in ecologically real concentrations. The researched pesticides and their mixtures caused inhibition of antioxidants, excessive production of reactive oxygen species, accumulation of lipid peroxidation products and increased DNA fragmentation. Chlorpyrifos was significantly more toxic than Roundup and additionally caused nitrosative and carbonyl stress. In groups of terbutylazine and malathion, the signs of oxidative stress were combined with relatively more intensive processes of apoptosis and autophagy, which ensured more efficient removal of oxidative damage products, particularly of fragmented DNA molecules, in the animals exposed thereto. The manifestations of oxidative stress, especially significant under the influence of chlorpyrifos and tebuthylazine, at the organism level causes development of signs of hepatotoxicity and neurotoxicity. In summary, Roundup demonstrated stimulation of cellular defence mechanisms at low concentrations, which was, however, levelled out by combined exposure to pesticides in presence of chlorpyrifos, meaning that Roundup-induced hormesis is unlikely to occur during typical environmental exposure to agrochemical mixtures. The pesticides we studied demonstrated moderate signs of endocrine disrupting effects. The most significant evidence of pesticide-induced endocrine disruption was observed in the case of combined exposure to terbutylazine and malathion, but was limited to vitellogenesis and the HPA axis, with little or no effect on the HPI or HPT axis. Given terbutylazine’s belonging to the chlorotriazine class, which includes atrazine, a known endocrine disruptor, the absence of significant hormone mirror disorders indicates the advantages of using terbutylazine as an atrazine substitute. The damage to mitochondria and lysosomes can be attributed to nonspecific signs of exposure to organophosphate pesticides and terbutylazine, which, in turn, create prerequisites for metabolic partitioning and energy deficit. Given that the mobilisation of defence mechanisms under stress is an energy-intensive process, energy deficit may be a limiting factor in the survival of individuals under increasing anthropogenic pressure. The combined effects of the studied pesticides on D. rerio were antagonistic. In such cases, the effects of individual pesticides in mixtures can be predicted on the basis of the individual effects of the more toxic pesticide. This is true for chlorpyrifos, but in the case of terbuthylazine and its combination with malathion, the resulting symptoms are not characteristic of the individual effects of the chemicals. Several recent reports have shown additive or synergistic effects of pesticide mixtures, including mixtures of organophosphates/urea and organophosphates/copper sulphate (Heys et al., 2016; Laetz et al., 2009; Weeks Santos et al, 2021), which means that antagonistic interactions cannot be overgeneralised, and that the expected effects of a mixture cannot be predicted by the more toxic component. Even though monitoring of more toxic pesticides (such as chlorpyrifos) might be justified in limitation of resources, future bioassays of toxicity of pesticide mixtures will improve environmental and health risk assessment by focusing on the most relevant biomarkers, such as oxidative stress, hepatotoxicity and neurotoxicity. By using machine learning methods, we identified an optimal set of biomarkers, that includes immune indicators (IgM), indicators of endocrine disorders (vitellogenin Vtg), indicators of DNA repair (RAD51) and cytotoxicity indicators (LDH), to evaluate the risks of pesticide exposure of non-target organisms and to assess the organism through determination of oxidative stress indicators (TBA-AP, Nrf2, total antioxidant capacity, GSSG), stress hormone cortisol and the key apoptosis enzyme Cas3.