Дослідження ролі металотіонеїнів у запальних процесах на моделях двостулкового молюска Dreissena polymorpha та лабораторних щурів

Abstract

Дисертаційна робота присвячена дослідженню ролі металотіонеїнів у реакції організму на вплив стресорних чинників запальної/антизапальної дії на моделях філогенетично віддалених організмів. Цинк (Zn) як імуномодулятор викликає посилену увагу дослідників у останні роки у зв’язку з пошуком ефективних засобів забезпечення реакції організму на стрес, пов’язаний з інфекційними захворюваннями, зокрема коронавірусною інфекцією (COVID-19) та численними мікрополютантами у довкіллі, у тому числі мікропластиком та фармацевтичними препаратами. Серед близько 3000 відомих Zn-зв’язуючих протеїнів, металотіонеїни (МТ), універсальні у живому світі внутрішньоклітинні термостабільні політіоли, вирізняються тим, що у фізіологічних умовах депонують Zn у клітинах та забезпечують його транспорт до інших молекулярних мішеней. Їх ролі як індуцибельних редокс-активних молекул приділяється суттєво менше уваги. Зокрема, очікується, що особливості балансу між Zn-буферною функцією та відповіддю на окисний стрес цих поліфункціональних протеїнів відіграють роль у запальних процесах. Проте імуномодулюючий ефект МТ досі не з’ясований. У якості модельних організмів були обрані прісноводні молюски виду дрейсена (тригранка) Dreissena polymorpha (Pallas, 1771) та щурі-альбіноси лінії Вістар. На моделі молюсків досліджували вплив таких імуномодуляторів як кофеїн та мікропластик окремо та у сумішах за двох температурних режимів та беручи до уваги особливості преадаптації в аборигенній та інвазивній популяціях. У щурів імунну реакцію вивчали за патології індукованого гонартриту. Для оцінки участі стрес-індуцибельних метал-депонувальних протеїнів металотіонеїнів у реакції організму на вплив імуномодуляторів аналізували загальну концентрацію цих протеїнів за вмістом тіолів (MTSH) та вміст їх цинк-депонувальної форми (Zn-МТ) у співставленні з показниками реакції окисного/відновного стресу, імунореактивності та апоптозу/аутофагії. Для реалізації мети дослідження використовувались методи препаративної біохімії, гістології, морфометрії, світлова та люмінесцентна мікроскопія, спектрофотометрія, хроматографічний та електрофоретичний аналізи та статистичний аналіз. Дисертаційне дослідження складалось з двох етапів. У І-й експериментальній серії ми порівнювали вплив імуномодулюючих чинників на молюсків D. polymorpha аборигенної (р. Дніпро поблизу м. Херсон, Kh) та інвазивної (р. Серет, Тернопільський став, Tn) популяцій. Для цього, молюсків D. polymorpha з двох популяцій впродовж 14-ти днів піддавали впливу мікрочастинок полістиролу розміром 2 мкм і концентрацією 1 мг·л-1 (MP), фармацевтичного препарату кофеїну (Caf) концентрацією 20,0 мкг·л-1, підвищеної температури 25 °C (Т) та суміші мікропластику з кофеїном за двох температурних режимів – 18 ℃ (Mix) та 25 ℃ (MixT). Концентрації кофеїну та МР відповідали екологічно реальним концентраціям речовин у природних водоймах. При цьому враховувалося, що саме пластик малого розміру частинок провокує імунні відповіді організму. Температурний режим 25 ℃ відповідав екологічно реальним значенням для прісних водойм у період збору молюсків. Досліджували показники у гомогенаті м’яких тканин. У ІІ-й серії досліджень у лабораторних щурів-альбіносів лінії Вістар досліджували участь МТ у реакції організму на запалення за гострого гонартриту (ГА). Для цього було сформовано дві групи – інтактний контроль (С) та патологія (GA). У щурів GA-групи індукували запалення шляхом одноразового внутрішньосуглобового введення 25 мкл 2 % карагенану в обидва коліна, тоді як особини інтактної С-групи отримували 25 мкл стерильного фізіологічного розчину. Тварин виводили з експерименту на 7-й день після введення карагенану, коли спостерігались значні запальні зміну суглобу. Визначали показники у супернатанті синовіальних тканин. Для оцінки реакції МТ на дію на організм імуномодуляторів з м’яких тканин молюсків та колінного суглобу щурів хроматографічно виділялись протеїни, які за ознаками термостабільності не денатурують за впливу температури 85 оС протягом 5 хв, мають молекулярну масу близько 7 кДа (підтверджено трицин SDS-PAGE електрофорезом), специфічний спектр поглинання з максимумом при 245–255 нм, що свідчить про наявність метал-тіолатних кластерів та відсутність ароматичних амінокислотних радикалів. Вплив стресорних чинників на молюсків у жодній групі з двох популяцій молюсків не провокував утворення димерів МТ, чи їх розпад на окремі кластери, що свідчить про відсутність екстремальних умов середовища. У тварин з ГА спостерігались ознаки часткової олігомеризації МТ, що може бути наслідком окиснення тіолів з утворенням олігомерів. Порівнюючи дві контрольних групи аборигенних та інвазивних молюсків, можемо стверджувати, що хоч і загальний рівень МТ не виявляв відмінностей, частка метальованого МТ (Zn-MT) у групі KhC становила 50 %, у той час як у інвазивній TnC-групі цей показник сягав 82 %, що вказує на відмінності у функціональному стані цього тіола та, відповідно, у залученні його до антиоксидантного захисту та депонування клітинного цинку. У представників інвазивної популяції усі кофеїн-вмісні експозиції (Caf, Mix, MixT) викликали збільшення концентрації МТ за рахунок апо-форми (до чотирьох разів за впливу суміші), що гіпотетично сприяло посиленню їх антиоксидантних можливостей, тоді як у аборигенних представників мало місце збільшення вмісту МТ за рахунок їх цинк-депонувальної форми за усіх експозицій (за винятком MP) та, за більшості експериментальних впливів, і неметальованої форми. Відтак, за впливу досліджених чинників двом популяціям була властива відмінність у стратегії функціонування МТ, що проявлялось як різниця у рівні секвестрації ними цинку. Рівень глутатіону та редокс-індекс глутатіону (RI GSH) підвищувалися у аборигенних молюсків, тоді як у інвазивних таких реакцій не спостерігалося. Визначення в інвазивній популяції концентрації купруму у тканинах виявило його збільшення, особливо за теплових впливів у TnТ- і TnMixT-групах (до 2,9 і 3,0 рази), що, у свою чергу, спричинило різке зниження співвідношення Zn/Cu у тканинах молюсків та, ймовірно, позначилось на редокс-потенціалі тіолових груп у МТ. У щурів за запального процесу в суглобах рівень протеїну МТ був підвищений, порівнюючи з контролем, як за загальною концентрацією протеїну (на 79 %), так і за концентрацією метальованої (Zn-вмісної) форми (на 46 %). При цьому, загальний рівень цинку в тканині суглоба за ГА не зазнавав змін, що вказує на залучення захисного механізму депонування цинку. Разом з тим, за патології спостерігався дисбаланс між діапазоном зростання концентрації загального протеїну МТ та його метальованої форми, що виявлялося у збільшенні частки неметальованих МТ (апо-форма). Відповідно, виникали умови для ефективного залучення МТ у антиоксидантний захист за рахунок незалучених у зв’язування цинку тіолових груп. Рівень глутатіону також знижувався на 28 %, що могло послаблювати його здатність захищати ліпіди від окисних ушкоджень та сприяти зростанню ролі тіолів MT у забезпеченні антиоксидантного захисту клітинним тіоломом при запаленні. Отже, в обох модельних ситуаціях (вплив хімічних та температурного чинників у молюсків та запалення у щурів), зростає вміст МТ за рахунок апо-форми. При цьому, в аборигенній популяції молюсків та у щурів збалансовано зростав і вміст метальованих МТ. Дослідження показників окисного/відновного стресу у молюсків виявило відмінності між контрольними групами, які свідчать про вищу активність системи антиоксидантного захисту в інвазивній популяції. Втім, за впливу MP в аборигенній популяції активувались антиоксиданти, зокрема, мітохондріальна форма супероксиддисмутази (Mn-SOD), тоді як у інвазивних молюсків таких реакцій не спостерігалося, натомість, підвищувався рівень карбонілів протеїнів на 26 %. Вплив кофеїну у Kh-популяції не викликав змін стану антиоксидантів, порівнюючи з контролем, тоді як у інвазивній популяції спостерігалося підвищення активності цитозольної Cu,Zn-SOD та зниження активності каталази. Вплив підвищеної температури також сприяв активації Cu,Zn-SOD у обох популяціях, але у Kh-популяції знижував активність каталази. При цьому, в інвазивній групі рівень окисних ушкоджень протеїнів підвищувався. Вплив МР у суміші з фармацевтиком у багатьох випадках виявляв кумулятивний ефект щодо реакції на окремі чинники, який проявлявся у активації Cu,Zn-SOD та каталази у обох популяціях, а також рівня перекисного окиснення ліпідів (TBARS) у Tn- та карбонілів протеїнів у Kh-групах, тоді як комбінований вплив за підвищеної температури пригнічував, або повністю нівелював ефект суміші. При цьому, рівні карбонілювання протеїнів зростали у Kh-популяції за усіх впливів (за винятком KhT) у аборигенних представників, тобто ця популяція виявляла меншу резистентність до впливу експозиційних чинників. Стан імунореактивності, визначений за активністю фенолоксидази та лаккази, у двох популяціях виявляв схожість реакції на вплив експозицій та проявлявся у пригніченні за впливу МР, відсутність реакції на вплив кофеїну та підвищеній активності за теплового та комбінованих впливів. Проте, не зважаючи на спільну стратегію відповіді імунореактивності в аборигенній та інвазивній популяціях молюсків, діапазон реакції був різним залежно від популяції. При патології ГА у щурів спостерігався дисбаланс активностей ензимів антиоксидантного захисту, що проявлялося в удвічі вищій активності SOD, порівнюючи з контролем, тоді як активність каталази знижувалася. Це могло призводити до накопичення H2O2 та, як наслідок, зростання рівня TBARS. Відтак, вплив низки стресорних чинників у молюсків та запалення у щурів ініціювали прояви окисного стресу, проте залежно від преадаптації у певному середовищі, негативний вплив МР був більш очевидним для аборигенних молюсків, тоді як на експозицію кофеїном чутливіше реагувала інвазивна група, а комбінована дія викликала в обох популяціях синергічний ефект. Порівняння реакцій складників клітинного тіолому свідчить про те, що саме МТ, а не глутатіон реагували на дію досліджених стресорних чинників. Активність ензимів апоптозу та аутофагії мала відмінності між контрольними групами молюсків з двох популяцій. Так, каспаза-3 та загальний катепсин Д у контрольній групі Tn-популяції проявляли в 1,8 та 1,5 раза вищі показники активності, що свідчить про короткочасність життєвого циклу цих молюсків. За умов експозицій, у обох популяціях тепловий та комбіновані впливи викликали найбільший ефект серед всіх експериментальних впливів на каспазу-3 та загальну активність катепсину Д. При цьому, у Kh-популяції досліджувані впливи були більш згубними, оскільки активація каспази-3 проявлялась у кожній експериментальній групі, а за впливу Mix спостерігався і посилений вихід катепсину Д з лізосом. Тест на лізосомальну цілісність виявив у 2,5 рази вищий рівень дестабілізації лізосом у контрольній групі інвазивної популяції. Експозиції сприяли загальній реакції зниження цілісності лізосом у двох популяціях, але зміни були більш відчутними в аборигенних молюсків. Відмінність відповідей на впливи імуномодуляторів у межах популяції були виявлені також на прикладі кислої фосфатази. МР інгібував загальну активність ензиму, тоді як усі кофеїн-вмісні впливи, особливо комбіновані, сприяли збільшенню показника мембранно-зв’язаної латентності фосфатаз (до 3,4 та 3,6 разів у TnMix- та TnMixT-групах відповідно), що говорить про активацію функціональної активності лізосом за цих впливів. Оцінка реакції організму щурів на індуковане запалення суглобів засвідчила підвищений рівень сіалових кислот у плазмі крові та зниження активності холінестерази у синовіальній тканині, що є ознаками гострої токсичності, пригнічення процесів регуляції розвитку та ремоделювання кісток. Застосування факторного аналізу підтвердило в обох модельних схемах, як на моделі двостулкового молюска, так і за гострого гонартриту, узгодженість у відповідях між МТSH та Zn-MT та показниками запального процесу та антиоксидантного захисту. Це свідчить про універсальний характер стратегії залучення метальованої форми МТ та їх апоформи до відповіді організму на вплив стресорних чинників. Порівняння реакцій на пошкоджуючі чинники у двох популяціях молюсків за допомогою дискримінантного аналізу продемонструвало суттєвий вплив преадаптації на здатність реагувати на стрес та специфіку відповіді. Зокрема, було підтверджено переваги інвазивної популяції над аборигенною у резистентності до стресових впливів, що виявлялось у малому діапазоні відмінностей у локалізації експериментальних груп залежно від природи діючого чинника, тоді як у аборигенній популяції всі групи були чітко дистанційовані. Було також відзначено особливості у реакції на МР та кофеїн залежно від преадаптації у біотопі та синергізм у експозиціях до комбінованої дії, який частково нівелювався тепловим чинником. Відтак, співставлення двох характеристик МТ – за вмістом тіолових груп та цинк-депонувальної форми, яке вкрай рідко використовується у дослідженні цих стрес-чутливих металодепонувальних протеїнів, довело, що ці протеїни беруть участь у редокс-реактивності організму на стресорні чинники, відмінні від їх типових індукторів – перехідних металів. Посилення цинк-депонувальної функції МТ є індикатором лабільності цинк-залежних процесів у організмі та стратегії кінцевих наслідків несприятливих впливів залежно від сили ураження та особливостей преадаптації до дії стресорного чинника.

The dissertation is devoted to the investigation of the role of metallothioneins in the response to the influence of inflammatory/anti-inflammatory stressors on models of phylogenetically distant organisms. Zinc (Zn) as an immunomodulator has attracted the increased attention of researchers in recent years in connection with the search for effective means of ensuring the organism's response to stress associated with infectious diseases, in particular, coronavirus infection (COVID-19) and numerous micropollutants in the environment, including microplastics and pharmaceuticals. Among about 3,000 known Zn-binding proteins, metallothioneins (MTs), the universal among living world intracellular thermostable polythiols, are distinguished by their ability to buffering Zn within the cells under physiological conditions and provide its transport to other molecular targets. Much less attention is paid to their role as inducible redox-active molecules. In particular, the particularity of the balance between the Zn-buffering function and the response to oxidative stress of these bifunctional proteins is expected to be involved in the inflammatory processes. However, the immunomodulatory effect of MTs have not been elucidated yet. In the present study, freshwater mussels Dreissena polymorpha (Pallas, 1771) and Wistar albino rats were chosen as model organisms. On the molluscs model, the effect of supposed immunomodulators, caffeine and microplastics, separately and in mixtures at two temperature regimes was studied, taking into account the peculiarities of their pre-adaptation in native and invasive populations. In rats, the immune reaction was studied under the pathology of induced gonarthritis. In order to assess the participation of stress-inducible metal-buffering proteins metallothioneins in the response of the organism to the influence of immunomodulators, the total concentration of these proteins determined from their thiol content (MTSH) and the concentration of their zinc-buffering form (Zn-MT) were analyzed in association with indexes of oxidative/reductive stress response, immunoreactivity and apoptosis/autophagy. The methods of preparative biochemistry, histology, morphometry, light and luminescence microscopy, spectrophotometry, chromatographic and electrophoretic analyzes and statistical analysis were used to achieve the goal of the study. The experiment was represented by two stages. In the 1st experimental stage, we compared the effect of immunomodulating factors on D. polymorpha molluscs from native (Dnipro River near Kherson, Kh) and invasive (Seret River, Ternopil Stav, Tn) populations. For this aim, D. polymorpha molluscs from two populations were exposed for 14 days to polystyrene microparticles with a size of 2 μm and a concentration of 1 mg·l-1 (MP), a caffeine of pharmaceutical quality (Caf) with a concentration of 20.0 μg·l-1, elevated temperature of 25 °C (T) and a mixture of microplastics with caffeine at two temperature regimes – 18 ℃ (Mix) and 25 ℃ (MixT). The concentrations of caffeine and MP corresponded to ecologically real concentrations of substances in natural water bodies. At the same time, it was taken into account that plastic of small particle size provokes the immune responses of the organism. The temperature regime of 25 ℃ corresponds to the ecologically real values for water in the studied areas during the collection of mussels. The parameters were studied in the homogenate of soft tissues. In the 2nd experimental series, the participation of MT in the response of the organism to inflammation during acute gonarthritis was investigated in Wistar albino laboratory rats. For this aim, two groups were formed - intact control (C) and pathology (GA). Gonarthritis was induced in rats of the GA-group by a single intra-articular injection of 25 μl of 2 % carrageenan into both knees, while individuals of the intact C-group received 25 μl of sterile saline. The animals were removed from the experiment on the 7th day after the introduction of carrageenan, when significant inflammatory changes in the joint were observed. Parameters were determined in the supernatants of the synovial tissues. To evaluate the reaction of MT to the action on the organism of immunomodulators, chromatographically were isolated proteins from the soft tissues of molluscs and the knee joint of rats that, according to signs of thermal stability, do not denature under the influence of a temperature 85 oC for 5 min, have a molecular weight of about 7 kDa (confirmed by tricine SDS-PAGE electrophoresis), a specific absorption spectrum with a maximum at 245–255 nm, which indicates the presence of metal-thiolate clusters and the absence of aromatic amino acid radicals. The impact of stressful factors on molluscs in none of two populations provoked the formation of MT dimers or their disintegration into separate clusters, which indicates the absence of extreme environmental conditions. Animals with GA showed signs of partial oligomerization of MT, which may be a consequence of oxidation of thiols with the formation of oligomers. Comparing the two control groups of native and invasive molluscs, we can say that although the total level of MT does not show differences, the part of metallated MT (Zn-MT) in the KhC-group was 50 %, while in the invasive TnC-group this indicator reached 82 %, indicating differences in the functional state of this thiol and, accordingly, in its involvement in antioxidant protection and cellular zinc deposition. In invasive representatives, all caffeine-containing exposures (Caf, Mix, MixT) caused an increase in the content of the apo-form MT (up to four times under the influence of the mixture), which hypothetically contributed to the strengthening of their antioxidant capacity, while in native mussels there was an activation of their zinc-buffer properties at all exposures (with the exception of MP), and under most experimental influences, its non-metalated form. Therefore, under the influence of the investigated factors, the two populations had a difference in the strategy of MT functioning, which was manifested as a difference in their zinc sequestration. In the native population the level of glutathione and the redox index of glutathione (RI GSH) increased under the influence of MP and Mix, while no such reactions were observed in invasive molluscs. Determination of copper content in tissues in the invasive population revealed its increase, especially under thermal effects in the TnT- and TnMixT-groups (up to 2.9 and 3.0 times), which, in turn, caused a sharp decrease in the Zn/Cu ratio in the tissues of molluscs and, probably affect on the redox potential of thiol groups in MT. In rats with an inflammatory process in the joints, the level of MT protein was increased compared to the control both in terms of the total protein concentration (by 79 %) and the content of the metalated (Zn-containing) form (by 46 %). At the same time, the total level of zinc in the joint tissue during gonarthritis did not change, which indicates the involvement of the protective mechanism of zinc deposition. However, under pathology, an imbalance was observed between the range of increase of the total MT protein content and its metallated form, which was manifested in an increase in the proportion of non-metallated MT (apo-form). Accordingly, there was the conditions for the effective involvement of MT in antioxidant protection due to thiol groups not involved in zinc binding. The level of glutathione was also reduced by 28 %, that can lead to its inability to protect lipids from oxidative damage and an increased role of MT thiols in providing antioxidant protection by the cellular thiolome during inflammation. Therefore, in both model situations (influence of chemical and temperature factors on molluscs and inflammation in rats), there is an imbalance of the metalated and apo-form of MT with an increase in the content of the last. At the same time, in the native molluscs and rats the content of metalated MT also increased in a balanced manner. The study of indicators of oxidative/reductive stress in molluscs revealed differences between control groups, which indicate a higher activity of the antioxidant defense system in the invasive population. However, under the influence of MP, antioxidants, in particular, the mitochondrial form of superoxide dismutase (Mn-SOD), was activated in the native population, while no such reactions were observed in invasive molluscs, in which, on the contrary, the level of protein carbonyls increased by 26 %. Exposure to caffeine in the Kh-population did not cause changes in the state of antioxidants compared to the control, while in the invasive representatives there was an increase in the activity of cytosolic Cu,Zn-SOD and a decrease in the activity of catalase. Exposure to elevated temperature also promoted activation of Cu,Zn-SOD in both populations, but decreased catalase activity in the Kh population. At the same time, the level of oxidative damage of proteins increased in the invasive group. The effect of MP in a mixture with pharmaceuticals revealed a cumulative effect in relation to the response to individual factors for most markers, which was manifested in the activation of Cu,Zn-SOD and catalase in both populations, as well as the level of lipid peroxidation (TBARS) in Tn- and protein carbonyls in Kh-representatives, while the combined effect at elevated temperature suppressed or completely eliminated the effect of the mixture. At the same time, the levels of protein carbonylation increased in the Kh-population under all exposures (except for KhT) in native representatives, that is, this population showed less resistance to exposure factors. The state of immunoreactivity, determined by the activity of phenoloxidase and laccase, in the two populations revealed a similarity in the response to the effects of exposures and manifested itself in inhibition under the influence of MP, no response to the influence of caffeine, and increased activity under thermal and combined effects. However, despite the common response strategy of immunoreactivity in native and invasive molluscs, the intensity of responses in both populations was different. Under the GA pathology in rats, an imbalance of the activities of antioxidant protection enzymes was observed, which was manifested in a two-fold higher activity of SOD, compared to the control, while the activity of catalase decreased. This could lead to the accumulation of H2O2 and, as a consequence, the increase in TBARS levels. Thus, exposure to a number of stressors in molluscs and inflammation in rats initiated manifestations of oxidative stress, however, depending on pre-adaptation in a certain environment, the negative effect of MР was more obvious for native molluscs, while the invasive group reacted more sensitively to caffeine exposure, and the combined effect caused a synergistic effect in both populations. Comparison of the reactions of cellular thiolome components shows that MT, and not glutathione, responded to the effects of the studied stressors. The activity of apoptosis and autophagy enzymes had differences between the control groups of molluscs from the two populations. Thus, caspase-3 and total cathepsin D in the control group of the Tn population showed by 1.8 and 1.5 times higher activity, which indicates the short life cycle of these molluscs. Under the experimental conditions, in both populations, thermal and combined exposition caused the greatest effect among all experimental factors on caspase-3 and the total activity of cathepsin D. At the same time, in the Kh-population the studied effects were more harmful, since the activation of caspase-3 was manifested in every experimental group, and increased release of cathepsin D from the lysosome was observed under the influence of Mix. Test on the lysosomal integrity revealed a 2.5-fold higher level of lysosome destabilization in the TnC-group. The effects of exposure contributed to a common reaction of a decrease in the integrity of lysosomes in the two populations, but the changes were more sensitive in native molluscs. Differences in responses to the effects of immunomodulators within the population were also revealed in acid phosphatase activity. MP inhibited the total activity of the enzyme, while all caffeine-containing exposures, especially combined, promoted an increase in the index of membrane-bound latency of phosphatases (up to 3.4 and 3.6 times in TnMix- and TnMixT-groups, respectively), that suggests activation of the functional activity of lysosomes under these influences. The assessment of the reaction of the rat’s organism to the induced inflammation of the joints showed an increased level of sialic acids in the blood plasma and a decrease in the activity of cholinesterase in synovial tissues, that are a sign of acute toxicity, suppression the processes of regulation of development and remodeling of bones. The factor analysis confirmed in both model schemes, both in the model of bivalve mollusc and in acute gonarthritis, consistency in the responses between MTSH and Zn-MT and indicators of the inflammatory process and antioxidant protection. This testifies to the universal nature of the strategy of involving the metalated and apoform of MT in the response of the organism to the stressors. Comparison of responses to damaging factors in two populations of molluscs using discriminant analysis demonstrated a significant influence of pre-adaptation on the ability to respond to stress and the specificity of the response. In particular, the superiority of the invasive population over the native population in resistance to stress was confirmed. It was manifested in a small range of differences in the localization of experimental groups depending on the nature of the stressor, while in the native population all groups were clearly distanced. Peculiarities in the reaction to MP and caffeine depending on pre-adaptation in the biotope and synergism in exposures to the combined action, which was partially neutralized by the thermal factor, were also noted. To summarise, the comparison of two characteristics of MT – according to the content of thiol groups and the zinc-depositing form, which is extremely rare used in the study of these stress-sensitive metal-depositing proteins, proved that these proteins participate in the redox reactivity of the organism to stressor factors different from their typical inductors – transition metals. Enhancing of the zinc-depositing function of MT is an indicator of the lability of zinc-dependent processes in the organism and reflect the strategy of the adverse outcome pathways depending on the severity of the injury and the features of pre-adaptation to the exposure.