Біохімічні механізми впливу мікропластику на організм двостулкового молюска Unio tumidus поокремо та за комбінованої дії

Abstract

Дисертаційна робота присвячена дослідженню біохімічних реакцій прісноводного молюска перлівниці Unio tumidus (Philipson et al., 1788) на дію мікропластика водного середовища залежно від розміру частинок окремо та у поєднанні з іншими несприятливими чинниками хімічного та екологічного походження. У якості біохімічних мішеней впливу ксенобіотиків було обрано акумуляційну здатність організму щодо есенціального металу цинку за участю металотіонеїнів, реакції окисного/відновного стресу та активність ензимів апоптозу та аутофагії. У роботі використано методи препаративної біохімії спектрофотометрія, хроматографічний та електрофоретичний аналізи, світлова та люмінесцентна мікроскопія, гістологічні та морфометричні дослідження, статистичний аналіз. Мета роботи зумовлена проблемою забруднення довкілля мікропластиком та його потенційної екотоксичності. Серед прогнозованих наслідків цього забруднення чільне місце займає здатність мікропластику сорбувати на своїй поверхні гідрофобні молекули та діяти як вектор, сприяючи контакту цих ксенобіотиків з організмом. Двостулкові молюски є загальновизнаними біоіндикаторами стану водойм, оскільки вони, завдяки фільтруючому способу харчування та осілому способу життя, акумулюють забруднювачі водного середовища та володіють механізмами реакції на стрес та токсичність середовища консервативними у тваринному світі. Разом з тим, двостулкові молюски здатні адаптуватись до умов існування у природному біотопі, та відповідно, демонструють залежні від популяції відмінності у резистентності до впливу пошкоджуючих чинників. Як ектотермні організми, вони чутливо реагують на температурний режим існування. Щодо потенційної токсичності мікропластику для двостулкових молюсків висновки суперечливі з огляду на високу фільтруючу активність організму, проте дослідження стосуються здебільшого гостротоксичної дії, а у поєднанні з перспективними щодо векторної взаємодії гідрофобними ксенобіотиками поодинокі. Тому метою роботи стало дослідження здатності U. tumidus акумулювати мікропластик водного середовища та пошук потенційних молекулярних мішеней, задіяних у біохімічну відповідь на його вплив окремо та у поєднанні з супутніми ксенобіотиками у субхронічній експозиції. Відповідно у дисертаційному дослідженні в І-й експериментальній серії ми оцінювали акумулятивну здатність перлівниці з антропогенно навантаженої території (р. Нічлава, Ct-популяція) щодо мікропластику (МР) розміром частинок 0,1-0,5 мм (подрібнений побутовий поліетилентерефталат, згідно з новою класифікацією за розміром – мезопластик) у концентрації 1 мг/л протягом 14 діб. Біохімічні реакції організму на вплив МР окремо та у поєднанні досліджували у двох наступних експериментах. II серія – перлівницю U. tumidus з двох територій – референтної (р. Случ, Pr-популяція) та антропогенно навантаженої (р. Нічлава, Ct-популяція) - впродовж 14 днів піддавали впливу мезопластику концентрацією 1 мг/л (МР), ібупрофену (IBU, фармацевтичної якості, 8 мкг/л (3,9 нМ)) окремо та їх суміші (Mіх). ІІІ серія - перлівницю з антропогенно навантаженої території (Ct-популяція) піддавали впливу МР (полістирол, Sigma Aldrich) розміром 2 мкм, концентрацією 1 мг/л, саліноміцину (Sal, концентрацією 6 мкг/л) окремо та у суміші за температурних режимів 18℃ (Mix) та 25℃ (MixT). Концентрації ксенобіотиків та розмір частинок МР відповідали їх характеристикам у природних водоймах, а температурний режим 25°C – встановленим показникам для прісних водойм у досліджуваній місцевості у літній час. З’ясовано, що перлівниця володіє високою здатністю акумулювати МР із середовища з максимальною кількістю частинок у м’яких тканинах на 8-10 доби інкубації, що становить ≈320-330 частинок з розрахунку на організм порівняно з 9,5 частинками у контролі, та узгоджено зі зниженням його кількості у дослідному середовищі. Ці результати дозволяють стверджувати про доцільність використання перлівниці як індикаторного організму для оцінки вмісту МР у водному середовищі. Серед біохімічних реакцій на вплив ксенобіотиків ми акцентували на здатності тканини травної залози депонувати есенціальний метал цинк за участю метал-депонувальних протеїнів металотіонеїнів. Металотіонеїни чутливо і селективно реагують на вплив не лише токсичних металів, але й на численні інші пошкоджуючі чинники хімічної та екологічної природи змінами як загального вмісту у тканині, так і ступенем металювання. Нами були виділені термостабільні протеїни, які за ознаками молекулярної маси ≈7 кДа, типових для метал-тіолатних кластерів, максимуму поглинанні при 245-250 нм та поведінки при трицин SDS-PAGE електрофорезі ідентифіковані як металотіонеїни. За експериментальних умов не спостерігали ознак їх димеризації. Порівняння контрольних груп з двох популяцій виявило відмінність у 3,5 рази у концентрації загального протеїну металотіонеїну з вищим вмістом у Pr-молюсків. За впливу МР у Ct-молюсків проявлялась типова реакція зростання рівня металотіонеїну як стрес-реакційних протеїнів, тоді як у Pr-молюсків їх вміст зменшувався. Вплив ібупрофену та суміші в обох популяціях призводив до зменшення вмісту металотіонеїну на 34-57% порівняно з відповідним контролем. Разом з тим, вміст метальованої форми металотіонеїну залишався незмінним порівняно з відповідним контролем за всіх експозицій за виключенням збільшення у групі Pr-Міх. Відтак забезпечувався стабільний рівень депонування цинку у складі металотіонеїнів, не зважаючи на зміни його загального вмісту у тканині (збільшення у Ct-МР та Міх та Pr-IBU групах). Разом з тим, лише за впливу МР у Ct-популяції зростав вміст неметальованої (апо-) форми металотіонеїну, що характеризується високою активністю тіолових груп. Дослідження впливу МР розміром 2 мкм окремо та у комбінації з антибіотиком саліноміцином за двох температурних режимів на організм молюска виявило зростання загального вмісту металотіонеїну за впливу на організм МР і саліноміцину, тоді як у Міх-групі він не змінювався, а у групі МіхТ зменшувався. Вміст цинку у складі металотіонеїнів зростав у всіх експозиціях, найпомітніші зміни спостерігали у Міх- та МіхТ-групах (у 4,4 і 2,9 раза відповідно). При визначенні загального вмісту цинку у тканині травної залози спостерігали іншу залежність ніж у складі металотіонеїнів, а саме зниження його вмісту за впливу МР та МіхТ, та збільшення у групі Міх. Відтак, не зважаючи на нестабільність рівня загального вмісту цинку у тканині, і у цій серії спостерігалась здатність металотіонеїнів забезпечувати певний резерв цинку, особливо у групах МР (21% загального вмісту цинку у тканині порівняно з 11% у контролі) та МіхТ. У цій дослідній серії було виявлено, що всі експериментальні умови викликають збільшення у три-п’ять разів вміст купруму у тканині. Відповідно, у всіх експериментальних групах зменшувалось співвідношенням вмісту цинку і купруму у тканині (у 6,9 раза за впливу саліноміцину). Відтак металотіонеїни відіграють важливу роль у депонуванні цинку у тканині травної залози за порушень його акумуляції та дисбалансу з купрумом, викликаних мікропластиком обох розмірів та фармацевтичними препаратами. У молюсків з референтної популяції та за теплового навантаження стрес-реакція металотіонеїнів на вплив ксенобіотиків послаблена. Оцінка реакції окисного/редуктивного стресу у травній залозі U. tumidus за впливу на організм МР різного розміру та фармацевтичних препаратів свідчить, що у Pr-популяції вплив МР пригнічував активність Cu,Znсупероксиддисмутази (SOD) та посилював утворення продуктів перекисного окиснення ліпідів (TBARS). Вплив ібупрофену окремо та в суміші викликав посилення карбонілювання протеїнів. На противагу, у молюсків з Ct-популяції за експериментальних впливів були виражені ознаки посилення антиоксидантного захисту, малоспецифічні до природи чинника: активація MnSOD на 185-300%, а за впливу ібупрофену й активація Cu,Zn-SOD, за впливу ібупрофену окремо та в суміші - пригнічення карбонілювання протеїнів на 37-26%. Каталазна активність не зазнавала змін за умов досліду. Відтак, залежно від популяції, у молюсків проявлялись ознаки пригнічення (Pr-популяція), або активації (Ct-популяція) антиоксидантного захисту, які були найбільше виражені за впливу МР, або ібупрофену відповідно. Ці результати не дають можливості виокремити індикаторні показники впливу МР окремо та у суміші. МР розміром 2 мкм не викликав змін системи окисного стресу у молюсків. Проте дія саліноміцину окремо та у суміші призвела до проявів окисного стресу – активації Mn-SOD та каталази, та зростання рівня карбонілювання протеїнів (саліноміцин). За підвищеної температури реакція каталази на вплив суміші пригнічувалась на 19% порівняно з контролем. Відтак МР викликав ознаки окисного стресу лише у Pr-популяції, тоді як обидва фармацевтики окремо та у суміші визначали помітні зміни у системі антиоксидантного захисту. Оцінка відновного статусу у тканині травної залози показала відмінність у стані системи глутатіону між контрольними групами з двох популяцій з меншим рівнем GSH та GSSG у Pr-популяції, проте показник GSH/GSSG між популяціями не відрізнявся. Різною була і реакція на експериментальний вплив: у молюсків з Pr-популяції система глутатіону помітно активувалась за впливу МР окремо та в суміші зі зростанням рівня GSH, GSSG та, за впливу МР, індексу GSH/GSSG. У молюсків Ct-популяції відбувались прооксидантні зміни у системі глутатіону у всіх експозиціях, проте баланс GSH/GSSG відповідав контролю. За впливу на організм МР 2 мкм показники системи GSH зазнавали ще помітнішого ураження. Вміст GSH та показник GSH/GSSG зменшувались за впливу МР, його сумішей, особливо за теплового впливу (до 50%). Вміст нікотинамідного коензиму NAD+ був удвічі вищим у Pr-, ніж у Ctконтрольних молюсків, проте співвідношення NAD+ /NADH було удвічі вищим у Ct-популяції. Разом з тим, в обох популяціях вплив експозицій викликав різку та неспецифічну реакцію редукційного стресу – зменшення цього співвідношення у діапазоні 37-88% від відповідного контролю. Редукційний стрес за ознаками зменшення частки NAD+ /NADH у тканині спостерігався й у молюсків III експериментальної серії за впливу всіх чинників внаслідок зростання концентрації NADH за виключенням МіхТ групи, у якій спостерігалось різке зменшення вмісту обох форм коензиму, демонструючи виснаження системи енергетичного забезпечення тканини. Відтак, зміщення до відновного стану у тканині характеризує неспецифічну реакцію на дію пошкоджуючих чинників, спільну для двох популяцій та всіх розглянутих експериментальних впливів. Популяційні особливості були виявлені і при визначенні активності показників апоптозу і лізосомальної функціональності, причому у Ct-популяції активність каспази-3, як ключового виконавчого ензиму апоптозу та лізосомальної протеази катепсину Д була вища, ніж в екземплярів Pr-популяції. МР 0,1-0,5 мм не впливав на активність каспази-3 в обох популяціях, тоді як ібупрофен окремо та у суміші у Pr-групах зменшував її на 37-38%, а у Ctпопуляції не викликав змін. У серії з дослідження МР 2 мкм та саліноміцину при температурі 18℃ спостерігали збільшення активності каспази-3 у всіх дослідних групах на 61-98%, тоді як тепловий вплив нівелював цей ефект суміші. У Pr-популяції відзначено також особливу реакцію в експозиціях – зменшення активності катепсину Д у лізосомах та його посилений вихід по-за лізосоми, особливо за впливу МР (на 240%). У молюсків Ct-популяції загальна активність катепсину Д зростала за впливу МР обох розмірів, ібупрофену, саліноміцину та їх поєднання. При цьому вивільнення катепсину Д з лізосом також зростало за впливу МР обох розмірів, ібупрофену (особливо) та поєднання МР з саліноміцином у двох температурних режимах. Узгоджену активацію цитоплазматичного та лізосомального шляхів апоптозу/аутофагії відзначено за впливу MP 2 мкм окремо та у поєднанні. Відтак, нами було виявлено низку неспецифічних біохімічних ознак у функціонуванні травної залози молюска, які характеризують його чутливість до змін середовища і здатність пластично пристосовуватись до них. Це акумуляція резерву цинку у складі металотіонеїнів, збільшення частки купрум/цинк, активація редокс системи та лізосомального катаболізму. Преадаптація молюсків до впливу несприятливих чинників середовища в антропогенно навантаженій місцевості визначає реакції на вплив МP обох досліджених розмірів окремо та спільно з фармацевтиками. Теплова дія нівелює реакції організму на комбінований вплив МР та фармацевтика. Доведено, що вплив МР залежить від його розміру і більше виражений для дії МР 2 мкм. За спільного впливу МР та фармацевтиків проявляється синергічний ефект. Запропоновано простий у виконанні метод визначення акумуляції MP розміром 0,1-0,5 мм у м’яких тканинах молюска та використання показників співвідношення NAD+ /NADH та Zn/Cu для оцінки реакції організму молюска на пошкоджуючий вплив довкілля.

The dissertation is devoted to the investigation of biochemical responses of the freshwater mussels Unio tumidus (Philipson et al., 1788) in the exposures to waterborne microplastics depending on the size of the particles separately and in combination with other adverse factors of chemical and environmental origin. The accumulation capacity of the important essential metal zinc with the participation of metallothioneins, the oxidative/reductive stress response and the activity of apoptosis and autophagy enzymes were selected as a biochemical targets in these exposures. The work utilised methods of preparative biochemistry, spectrophotometry, chromatographic and electrophoretic analyses, light and luminescent microscopy, histological and morphometric studies, and statistical analysis. The aim of the study is determined by the problem of environmental pollution with microplastics and its potential ecotoxicity. Among the predicted consequences of this pollution, the ability of microplastics to adsorb hydrophobic molecules on its surface and act as a vector, contributing to the contact of these xenobiotics with the organism, caused a main concern. Bivalves are generally recognized bioindicators of the water quality due to their filter feeding and sedentary lifestyle, that provide the accumulation of pollutants in the aquatic environment, and in respect to their sensitivity to environmental stress and toxicity, which are conservative in the animal world. At the same time, bivalve molluscs are able to adapt to the environmental conditions in their native biotope, and, accordingly, show population-dependent differences in resistance to the influence of damaging factors. As ectotherm organisms, they respond sensitively to the temperature regime. Regarding the potential toxicity of microplastics for bivalve molluscs, the views are contradictory due to the high filtering activity of the organism. However, the studies are mostly devoted to the acute toxic effect, and mostly they are not focused on the expected vector interaction with hydrophobic xenobiotics. Therefore, the aim of this study was to investigate the ability of U. tumidus to accumulate waterborne microplastics and the selection of prospective molecular targets involved in the biochemical response to its effect alone and in combination with related xenobiotics in subchronic exposures. Accordingly, in the dissertation work, in the 1st experimental series, we evaluated the accumulative capacity of mussels from an anthropogenically loaded area (Nichlava River, Ct-population) concerning to microplastics (MР) with a particle size of 0.1-0.5 mm (shredded household polyethylene terephthalate, according to the new size classification - mesoplastic) at a concentration of 1 mg/l for 14 days. In the next two experiments, biochemical responses of the mussels to the effect of MР separately and in combination were studied. Series II - U. tumidus from two areas - reference (Sluch River, Pr-population) and anthropogenically loaded (Nichlava River, Ct-population) - were exposed to mesoplastic at a concentration of 1mg/l (MP), ibuprofen (IBU, pharmaceutical grade, 8 µg/l (3.9 nM) separately and their mixtures (Mix) for 14 days. Series III - mussels from an anthropogenically loaded area (Ct population) were exposed to MP (polystyrene, Sigma Aldrich) with a size of 2 μm, at concentration of 1 mg/l, salinomycin (Sal, a concentration of 6 μg/l) separately and in a mixture at 18℃ (Mix) and 25℃ (MixT). Concentrations of xenobiotics and the size of MP particles corresponded to their characteristics in natural wter bodies, and the temperature regime of 25°C corresponded to the established temperature for water in the studied area in summer. It was found that the mussels have a high ability to accumulate MP from the environment with the maximum number of particles in soft tissues at 8-10 days of incubation (≈320-330 particles per organism compared to 9.5 particles in the control), accordingly to decrease in its quantity in the experimental environment. Basing on these results, we recommend the utilizing of freshwater bivalve U. tumidus as an bioindicator for assessing the content of MP in the aquatic environment. Among expected biochemical responses on the exposures to xenobiotics, we focused on the ability of the digestive gland tissue to accumulate the essential metal zinc with the participation of metal-buffering proteins metallothioneins. Besides the responses to toxic metals, metallothioneins sensitively and selectively react on plural other damaging factors of a chemical and ecological nature by changes in both the total content in the tissue and the degree of metalation. We eluted the thermostable proteins, which were identified as metallothioneins based on molecular weight of ≈7 kDa, absorption maximum at 245- 250 nm typical for metal-thiolate clusters, and behavior during tricine SDS-PAGE electrophoresis. Under the experimental conditions, no signs of their dimerization were observed. Comparison of control groups from the two populations revealed a 3.5-fold difference in the concentration of total metallothionein protein with a higher content in Pr-molluscs. Under the influence of MP, Ct-molluscs showed a typical reaction of an increase in the level of metallothioneins as stress-responsive proteins, while their content decreased in Pr-molluscs. Exposure to ibuprofen and the mixture in both populations resulted in a 34-57% decrease in metallothionein content compared to the respective control. However, the content of the metalated form of these proteins remained unchanged compared to the corresponding control at all exposures, except an increase in the Pr-Mix group. Therefore, a stable level of zinc deposition in the composition of metallothioneins was provided, regardless of changes in its total content in the tissue (increase in Ct-MP, Mix and Pr-IBU groups). At the same time, the content of non-metalated (apo-) form of metallothioneins that characterized by high antioxidant activity of thiol groups increased only under the influence of MP in the Ct population. The study of the effect on mollusk of 2 μm MP alone and in combination with the antibiotic salinomycin under two temperature regimes showed an increase in the total content of metallothioneins under the exposures to MP and salinomycin, while it did not change in the Mix group and decreased in the MixT group. The content of metallothionein-bound zinc increased in all exposures, the most noticeable changes were observed in the Mix- and MixT groups (by 4.4 and 2.9 times, respectively). When the total content of zinc in the tissue of the digestive glan was indicated, a different regularity than for the composition of metallothionein was indicated. In particular, a decrease in its content under the effect of MP and MixT, and an increase in the Mix group were shown. Therefore, regardless of the instability of the level of total zinc content in the tissue, the ability of metallothioneins to provide a certain reserve of zinc was also observed in this series, especially in the MP groups (21% of the total zinc content in the tissue compared to 11% in the control) and MixT. In this experimental series, all exposures were found to cause a three- to fivefold increase in copper content in the tissue. Accordingly, the ratio of zinc to copper content in the tissue decreased (by 6.9 times under the influence of salinomycin). Hence, metallothioneins play an important role in the accumulation of Zinc in the tissue of the digestive gland under the disturbance of its accumulation and imbalance with Copper caused by microplastics of both sizes and pharmaceuticals. In molluscs from the reference population and under elevated temperature, the stress reaction of metallothioneins to the exposures was aleviated. Evaluation of the oxidative/reductive stress response in the digestive gland of U. tumidus under the influence of MPs of different sizes and pharmaceuticals on the organism shows that in the Pr population, exposure to MPs inhibited the activity of Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD) and increased the formation of lipid peroxidation products (TBARS ). Exposure to ibuprofen alone and in a mixture caused an increase in protein carbonylation. On the contrary, in molluscs from the Ct population, under experimental exposure, there were pronounced signs of increased antioxidant protection, not specific to the nature of the factor: activation of Mn-SOD by 185- 300%, and ibuprofen solely induced the Cu,Zn-SOD activity and the ibuprofen solely and in mixture suppressed the protein carbonylation by 37-26%. Catalase activity did not change under the experimental conditions. Therefore, depending on the population, molluscs showed signs of inhibition (Pr-population) or activation (Ctpopulation) of antioxidant defence, which were most pronounced under the effect of MP or ibuprofen, respectively. These results do not make it possible to select the markers of the impact of MP separately and in a mixture. MP with a size of 2 μm did not cause changes in the oxidative stress system in molluscs. However, the action of salinomycin alone and in a mixture led to manifestations of oxidative stress - activation of Mn-SOD and catalase, and an increase in the level of protein carbonylation (salinomycin). At elevated temperature, the reaction of catalase to the influence of the mixture was inhibited by 19% compared to the control. Therefore, MP caused signs of oxidative stress only in the Pr-population, while both pharmaceuticals separately and in a mixture determined noticeable changes in the antioxidant defense system. Assessment of the reductive status in the digestive gland tissue showed a difference in the state of the glutathione system between the control groups from two populations with a lower level of GSH and GSSG in the Pr population, but the GSH/GSSG ratio was the same in both counterparts. The response to exposures was also different. In molluscs from the Pr population, the glutathione system was significantly activated under the effect of MP alone and in a mixture with an increase in the level of GSH, GSSG and, GSH/GSSG index (under the effect of MP). Ctmolluscs had shown the pro-oxidant changes in the glutathione system in all exposures, but the GSH/GSSG balance was not significantly changed in respect to control. Under the effect of MP 2 μm, the indices of the GSH system had shown even more noticeable damage. The GSH content and the GSH/GSSG ratio decreased under the influence of MP and its mixtures, especially under heating (up to 50%). The content of the nicotinamide coenzyme NAD+ was twice as high in Pr- than in Ct-control molluscs, but the NAD+ /NADH ratio was twice as high in the Ctpopulation. At the same time, in both populations, the impact of the exposures caused a sharp and non-specific reaction of reduction stress - a decrease in this ratio in the range of 37-88% of the corresponding control. Reductive stress was also observed in molluscs of the experimental series under the influence of all factors due to the decrease in the ratio of NAD+ /NADH in the tissue as the consequence of increase in the concentration of NADH/ One exception was the response of MixT group, in which a sharp decrease in the content of both forms of the coenzyme was observed, demonstrating the depletion of the energy supply system of the tissue. Therefore, the shift to the reductive state in the tissue characterizes a non-specific reaction to the effect of damaging factors shared between two populations and all applied exposures.Population peculiarities were also revealed under the indication of apoptotic activity and lysosomal functionality. Particularly, in the Ct population, the activities of caspase-3, the key executive enzyme of apoptosis, and the lysosomal protease cathepsin D was higher than in the specimens of the Pr-population. MP 0.1-0.5 mm did not affect the activity of caspase-3 in both populations, while ibuprofen alone and in a mixture in the Pr-groups reduced it by 37-38%, and in the Ct-population it did not cause changes. In the exposures to MP 2 μm and salinomycin at a temperature of 18oC, an increase in caspase-3 activity was observed in all experimental groups by 61-98%, while thermal exposure aleviated this effect of the mixture. In the Prpopulation, a specific response to exposures was also noted - a decrease in the activity of cathepsin D in lysosomes and its enhanced exit from lysosomes, especially under the influence of MP (by 240%). In Ct-population molluscs, the total activity of cathepsin D increased under the influence of MP of both sizes, ibuprofen, salinomycin, and their combination. At the same time, the release of cathepsin D from lysosomes also increases under the influence of MP of both sizes, ibuprofen (especially) and the combination of MP with salinomycin in two temperature regimes. Coordinated activation of cytoplasmic and lysosomal pathways of apoptosis/autophagy was noted under the influence of 2 μm MP alone and in combination. Summarizing, we discovered a number of non-specific biochemical signs in the functioning of the mollusk's digestive gland, which characterize its sensitivity to environmental changes and the ability to plastically adapt to them. These biochemical signs are the accumulation of the zinc reserve in the composition of metallothioneins, an increase in the proportion of copper/zinc, activation of the redox system and lysosomal catabolism. Pre-adaptation of molluscs to the influence of adverse environmental factors in an anthropogenically loaded area determines the reactions to the influence of MP of both studied sizes separately and in combination with pharmaceuticals. The heating reduced the responses of the organism to the combined effect of MP and pharmaceutical. It has been proven that the effect of MP depends on its size and is more pronounced for the effect of MP 2 μm. Under the joint influence of MP and pharmaceuticals, a synergistic effect is manifested. It as proposed the easy-to-implement method for determining the accumulation of 0.1-0.5 mm MP in the soft tissues of the mollusc and analysis of the NAD+ /NADH and Zn/Cu ratios to assess the response of the mollusc to the harmful effects of the environment.