Ефективність різних методів екстракції ДНК, придатної для ПЛР із гербарних зразків водоростей роду Cladophora Kütz

Abstract

Екстракція ДНК із водоростей має свої особливості, оскільки вони містять різні полісахариди та поліфеноли, які є інгібіторами ПЛР. Це вимагає оптимізації методу екстракції ДНК для різних груп водоростей. Зокрема, види роду Cladophora мають високу морфологічну мінливість, що залежить від умов навколишнього середовища та періоду розвитку водоростей. Застосування молекулярно-генетичного аналізу може допомогти у вирішенні таксономічних та філогенетичних питань цього роду зелених водоростей. У зв’язку з цим, метою роботи було підібрати методику екстракції ДНК із гербарних зразків водоростей видів роду Cladophora та апробувати виділену ДНК у ПЛР. У дослідженні порівнювали два методи екстракції ДНК із наборами реактивів SureFood PREP Basic компанії R-Biopharm та Quick DNA Mini Prep компанії Zymo Research. ДНК перевіряли у ПЛР з використанням універсального праймера iPBS 2080 із застосуванням різних реакційних сумішей, що містять Dream-Taq-полімеразу та Sso7d ДНК-полімеразу. У ході експерименту встановлено, що концентрації ДНК і співвідношення А260/А280 та А260/А230, отримані із зразків, екстрагованих набором SureFood PREP Basic, були значно кращими, проте використання їх у ПЛР не дало позитивного результату, імовірно, через наявність значної кількості інгібіторів. ДНК, екстрагована набором Quick DNA Mini Prep за співвідношеннями А260/А280 та А260/А230, значно поступалася, але, очевидно, містила меншу кількість інгібіторів ДНК-полімерази. Це дозволило отримати чіткі фрагменти ампліфікації в ПЛР з праймером iPBS 2080, проте у варіанті із застосуванням високоефективної із підвищеною стійкістю до інгібіторів полімерази Sso7d.

DNA extraction from algae presents unique challenges due to the production of various polysaccharides and polyphenols, which can act as PCR inhibitors. Consequently, optimizing DNA extraction methods becomes necessary for different groups of algae. The Cladophora genus, known for its high morphological variability influenced by environmental conditions and developmental stages, can benefit from molecular genetic analysis in addressing taxonomic and phylogenetic inquiries within the green algae family. In this context, the primary objective of this study was to select an appropriate DNA extraction method for herbarium specimens of Cladophora algae and evaluate the extracted DNA's suitability for PCR. The study compared two DNA extraction methods, namely the SureFood PREP Basic kit from R-Biopharm and the Quick DNA Mini Prep kit from Zymo Research. Subsequently, the isolated DNA was subjected to PCR using the universal primer iPBS 2080 with different reaction mixtures containing Dream-Taq polymerase and Sso7d DNA polymerase. The results revealed that the DNA concentrations and purification rates obtained from samples extracted using the SureFood PREP Basic kit were notably superior. However, PCR using these DNA samples did not yield positive results, likely due to the presence of inhibitors. On the other hand, DNA extracted using the Quick DNA Mini Prep kit exhibited lower purification rates but likely contained fewer DNA polymerase inhibitors. This allowed for successful amplification with the iPBS 2080 primer, utilizing the high-efficiency Sso7d polymerase, known for its resistance to inhibitors.